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作者：《农财宝典》新牧网记者 李萧佳
当前猪病检测形势越来越复杂，在临床上出现疑难杂症、非典型病征以及混合感染等情况时很容易出现误判，第一时间确诊病原十分关键。2021年11月8日，在“一次检测、即刻确诊！”系列直播节目第二期，牛津纳米孔技术公司的高级现场应用专家许峰博士、勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司上海分公司实验室运营经理柴伟东博士分享了《2021年猪病检测痛点分析与新技术探讨》。
纳米孔测序技术可快速筛查特定病原变异株增加，疫病诊断难度越来越大，如何找到原发病原？柴伟东介绍了当前常见检测类型的检测方法与判定标准，如图所示：
以河南某养殖场为例，部分仔猪出现肌肉震颤和八字腿的症状，淋巴结充血肿大，肠系膜淋巴结呈乳白色，大脑、小脑充血，肾脏有针尖状出血点或大的出血斑，呈现所谓的“雀斑肾”外观，场内之前有猪瘟和乙脑检出。柴伟东介绍，该猪场送脾脏、肾脏到HMC（健康管理中心）做检测，乙脑、APPV结果为阴性。为了找到目标病原，送淋巴结、脑、脾脏、肾脏到HMC进行纳米孔测序。
测序结果分析：1、 细菌读取片段数约占总量的8.824%，病毒读取片段百分比为0.042%；2、APPV：281条序列，微生物丰度55.2%；PEDV序列数为20，微生物丰度为3.92%；JEV序列数为1。
通过对检测结果复盘，1、检测样本的选择。第一次使用常规荧光定量PCR也检测了APPV，但没有检测到病原，是因为样本选择不对，检测应涵盖扁桃体与脑组织；2、观察临床症状表现与检测病原的一致性；3、 与CSF和JEV的鉴别诊断；4、 驯化工作可以很好的防控好目标疾病；6、其他疾病的考虑。
柴伟东表示，纳米孔测序，不仅可以知道某种特定病原，还把样本中所有致病病原找到。他强调，除了常规病原外，一些非常规病原也应该引起重视，比如盖它病毒、布尼亚病毒、猪星状病毒等。
纳米孔测序拥有对读长不受限制、可实时测序等三大优势许峰介绍，牛津纳米孔技术（ONT）公司的目标是让任何人在任何地点对任何物种进行测序。牛津纳米孔测序技术在不同的领域已经有广泛的应用，比如科研领域、人类健康领域、生物安全领域，以及工业界与教育领域等。牛津纳米孔测序技术的测序平台如MinION是一个便携性的仪器，因此它可应用于不同的应用场景，比如太空站、以及极端环境等。
纳米孔测序有什么优点？许峰表示，主要有三方面的优势：
1、纳米孔测序能够对DNA分子和RNA分子进行直接测序，它不经过PCR的反应，因此保留了DNA分子或者RNA分子上的一些原始的修饰信息。
2、ONT技术对于读长是不受限制的，它的限制只是在于提取DNA片段的长度。
3、纳米孔测序是一个实时测序。实时测序表现在测序的开始和停止都可以人为控制，能够随时开始和随时停止。ONT开发了一种实时分析的软件EPI2ME，这个软件就能够实时对于环境样品里面的微生物进行鉴定、测序以及数据分析。
“ONT在测序的准确性方面，”许峰介绍，“ONT最近推出了Q20试剂，该试剂采用了新型的马达蛋白，马达蛋白过孔速度比常规的稍微慢一点，但是它的准确度能够达到99%以上。这款试剂盒也能够在目前比较流行的R9芯片上进行测试，也可以在我们最近推出的R10.4芯片进行测试，它的准确度都能达到比较理想的要求。”
R10芯片与R9芯片有何区别？许峰表示，R10芯片读取序列的结构比R9芯片长，因此R10芯片的准确度也相对较高。从组装后的基因组与参考序列的比对准确性来看，ONT技术在R9芯片上的准确度能够达到Q45；在R10芯片上能够达到Q50，Q50的意思是ONT组装后的基因组与参考基因组相似度是在99.999%。
三大案例，诠释ONT技术在基因组流行病学的应用ONT技术在动物疫病的基因组流行病学中应用广泛。许峰介绍：1、ONT能做风险监测，鉴定新的致病菌，发现潜在风险；2、通过基因组序列测定，获得致病菌的基因组信息，然后通过基因组的信息，可以开展变异检测，利于新型疫苗的开发；3、通过系统发育分析以及溯源分析了解致病菌的传播途径，对于传播过程中的情况进行鉴定，然后将这些信息反馈给政府机构或者决策者，利于防控决策。
许峰针对ONT技术在基因组流行病学的应用做了详细地阐述，举了三个例子：
一、玛氏全球食品安全中心开发了食源性致病菌 - 沙门氏菌血清型的新的快速鉴定方法，这个方法在一天内就可以完成从样品制备到血清型的结果，从而对沙门氏菌进行溯源分析，对于食品工业界来说是至关重要的。
二、第二个案例是关于非洲猪瘟疫苗，目前因为没有非洲猪瘟病毒的疫苗，主要是根据快速诊断以及快速鉴定来做相应的防控措施。因此，全基因组测序作为快速诊断方式，对该病毒的防控有至关重要的作用。非洲猪瘟病毒是DNA病毒，片段长度达180KB左右，传统的一代测序和二代测序想要测出全基因组序列存在一定困难。ONT技术在6分钟的时候就能够进行非洲猪瘟的快速检测，测序10分钟就可以拼接出完整的基因组，这为非洲猪瘟的快速诊断提供了技术手段。
三、禽流感病毒是RNA病毒，可引起人畜共患病。针对该病毒的毒株已有疫苗，但是若出现新的突变株，那现有疫苗就无法有效管控。ONT技术可进行快速对禽流感病毒及其突变出进行有效鉴别，从而可以看当前的疫苗对新病毒是否有效，并将结果及时反馈至政府相关机构，进行后续的疫苗研发工作。
互动问答：1、这个新技术听上去挺简单的，那是不是我们每个普通的实验室都可以配置和应用呢？
许峰：ONT技术的愿景是让任何人在任何地点进行任何物种的测序，因此一般实验室都是可以配备的。通过一次培训，技术人员就可以上手操作。我们推荐从最基本的MinION启动套装（包含两张芯片与1个建库的试剂盒），所有用户都可以进行ONT测序。
柴伟东：从理论上每个人都可以做。如果要做到深度分析的话，还是需要一些高档的仪器、设备和芯片，需要专业人员对复杂序列进行更多深度分析。
对中小养殖企业来说，还是没有强烈的必要性去投入一定的资本、人员专门做这个事情，还是要降本增效。
2. 纳米孔测序对样本要求非常高，那我们在临床采样和运输过程中有什么需要注意的呢？
许峰：纳米孔测序对样品的要求主要表现在上样的DNA上，对DNA的量和质量有要求。DNA如果存在污染的话，有可能对于纳米孔进行造成损害，对于后续的产量和数据的质量都有所影响。
采样方面，我们推荐新鲜的样品，因为新鲜的样品提取出来DNA或者扩增出来的产物是比较好的。当然如果没有条件，冷冻的样品也是可以的，比如，我分享的非洲猪瘟那个案例里面也提到了，研究者曾经尝试使用冷冻的样品进行提取与后续的ONT测序，也是能够拿到结果的，但我们还是推荐使用新鲜的样品。
柴伟东：如果养殖企业距离比较远，保证不了新鲜的样本，建议大家尽量冷冻，而不是用湿冰方式（冷藏），否则DNA或RNA可能出现不同程度地降解，导致测序失败。
此外，建议养猪人要注意采集的样本，比如有猪场主要存在呼吸道的症状，这个时候需要采扁桃体、淋巴结和肺等与呼吸道相关的一些组织来进行检测，如果所检测的是肠道、肾脏组织，往往是达不到检测目的的。采样时间也需要注意，尽量采集正在发病的样本，而不是疾病发生前期或末期的样本，否则检测成功的概率会降低。
3. 纳米孔有一个特点是长读长，这个“长读长”为什么这么重要？
许峰：举一个简单的例子，大家都熟悉拼图游戏，如果片段长读比较长，就相当于一个大的碎片，而短读长是一些小的碎片。大的碎片更容易拿到完整的图，并且能够拿到基因组上的完整的信息，短读长拼接起来就比较麻烦，还有可能有信息缺失。
我们针对核酸来讲的话，ONT技术能够进行精准的组装，长读长更容易拿到完整的基因组。而二代的短读长测序容易碰到一些问题，比如串联重复序列等，二代测序短读长序列是不能够解决的，或者存在一定困难。另外，长读长容易取得基因组上大片段的结构变异信息。
柴伟东：除了非瘟以外，猪场更关注蓝耳病毒、 PEDV病毒，如果我们只是针对几百个 bp去判断是哪个毒株类型的话，往往可信度没有那么高。如果我们用纳米技术检测，其实可以把蓝耳病毒的全序列一下子全部读取出来，这样更容易或者更全面地去判断它属于哪个毒株类型。
4. 目前我们拿到的数据读长大多数还没有超过10K的，如何提高测序样本的读长呢？
许峰：ONT测序技术对于读长没有任何要求，它的测序读长完全取决于样品提取过程中的读长。所以说，如果要改进读长的问题，就要考虑样品怎么去更好地提取，如何提取出来一个长片段，甚至超长片段的样品。
我们建议在做三代测序样品提取的时候，不要用移液枪进行剧烈吹吸；涡旋尽量时间短，力度要尽量小，不要打断 DNA；要做超长读长的DNA的提取，推荐使用ONT推荐的NEB相关试剂盒。
5. 通过纳米孔测出来很多病原，如何确定哪个病原是真正的目的病原？
许峰：我们可以通过测序获得的序列进行生物信息分析，鉴定出来哪一个物种是占丰度比较高的，然后就针对丰度比较高的几个病原菌，通过查阅相关文献或资料，结合这几个物种的症状表现，看文献中的症状表现是不是和目前出现疫病的症状一致。如果是一致的话，我们就可以初步判断这是我们想找的一个病原。
柴伟东：就像我刚才所讲的案例，从临床症状可以大概推测出是哪几种病原，但是当我们通过纳米孔测序的时候，细菌读取片段占比高于病毒读取片段，这个时候是不是说明主要是细菌引起的？但往往不是这样的。
这个时候我们要关注临床症状与检测结果能不能对应起来，比如说我们发现仔猪有颤抖，肌肉震颤，这个时候我们通常就会想到一些神经症状，是由一些病毒引起的。之后我们会特定锁定在某几个病原之内，通过纳米孔测序所拿到的信息和临床对应起来，只要能对应得起来，我觉得它就是一个主要的致病原，或者说是它的原发病原。
6. 这个方法的敏感性怎么样？或者说与荧光定量PCR相比，敏感性怎么样？
许峰：如果把ONT和荧光定量PCR进行对比的话，这就是属于致病菌检测范畴。对于检测来讲，不管是荧光定量PCR还是ONT技术，最初的一步都是通过特异性的引物进行扩增，再进行ONT平台的测序。因为我们都是采用了特性 PCR扩增，所以就说ONT技术和荧光定量PCR技术的敏感性是一致的。
柴伟东：您的意思是只要荧光定量PCR能够检测到的病原，理论上都能通过纳米孔测序测出来，或者说通过纳米孔测序能够拿到这个病原数据，可以这么理解吗？
许峰：是的。其实对样品的丰度是有所要求的，我们可以通过两种方式进行目标物的富集，一是通过富集培养的方式；二是通过PCR扩增手段对目标物进行富集。
7. 拿到结果后，可以通过哪些指标来评价本次实验结果的可靠性？
许峰：我们可以从两个层面去评估，第一个层面是ONT的下机数据。对于原始的下机fastq数据，第一个指标是质量值，看测序出来的数据有多少大于ONT内部建议质量值；第二个指标是片段的长读，比如将平均片段长读以及片段长读的N50进行评估；第三，如果有参考序列，也可以把这些所有的序列和参考序列进行对比，然后看目标菌株所占的片段数量占总测序产生数量的百分比。
第二个层面是根据原始数据进行后续的生物信息的分析，包括组装后、修正后或的基因组，看下基因组的大小，N50，contigs数量，以及和参考基因组的一致性准确性。
