核酸检测ROX线正常人参考范围(核酸检测rox是什么)

MIQE指南中明确提出，进行qPCR实验时必须测定以下检测性能特点：PCR的效率、线性动态范围、LOD和精密度。

1、PCR的效率：

强大和精确的qPCR测定通常具有高效率。在报告目的基因相对于参照基因的mRNA浓度时，PCR效率是非常重要的。ΔΔCq方法是测定样本和用来标准化的单个参照基因之间浓度差异的最常见的方法之一。如果计算出目的基因与参照基因的Cq值的差异(ΔCq)，就可以将不同样本的ΔCq值直接进行比较。值得注意的是，两个基因的比较，必须在相似的扩增效率下进行。然而最常见的方法不一定是最合适的，相反已经开发了更为普通的定量模型用于校正扩增效率的差异[1]和多个参照基因的使用[2]。

PCR扩增效率必须通过校准曲线法建立，因为校准法简单、快速、重现好，保证了PCR的平均反应效率、分析灵敏度和检测方法的稳健性。扩增效率，要通过校准曲线线性部分的斜率计算，具体计算公式为：PCR效率= 10-1/slope-1，即以初始模板浓度的对数为X轴(自变量)，以Cq值为Y轴(因变量)作图。理论上效率的最大值为1.00 (或100%)，此值表明每个循环周期的产物量加倍。理想情况下，所报道的平均PCR效率的CI (可信区间)或SE (误差)值应该通过两次校准曲线法得到。

发表文章时，除了要提交每个定量目标的校准曲线外，还要提供校准曲线的斜率和在Y轴上的截距。PCR效率的差异会产生不同斜率的校准曲线。随着模板量的变化，目的基因和参照基因Cq值的差异并非固定不变，因此，按照固定Cq值计算得到的相对浓度是不准确的，可能会产生误导结果。

大于40的Cq值是可疑的，由于其效率较低，建议不要报道。然而这种随意设定Cq临界值的做法是不科学的，因为这些值可能很低(可消除有效的结果)也可能很高(能增加假阳性结果)。

2、线性动态范围：

PCR反应的动态范围应该呈线性，即最高或最低的定量拷贝数应该通过平均校准曲线法得到，提交的文章应该包括线性动态范围。校准曲线的产生依赖于所使用的模板，动态范围应跨越至少3个数量级，最好扩大到5或6个1og10浓度范围。校准曲线的线性区间必须包括目标核酸的定量范围。由于定量下限的界定往往很混乱，因此应该报告提交文章中所谓线性范围内最低浓度处的变异。另外还必须报告线性相关系数( R2值)，并且最好提供整个线性动态范围内的CI值。

3、检测限：

检测限定义为能够检测到95%的阳性标本的最低浓度。换言之，将浓度在LOD水平处的待测样本进行多次重复测定，测得无效结果的概率小于5%。低拷贝PCR的出现是随机有限的，而且不可能发生单次PCR的LOD值小于3个拷贝数的情况。然而，如果进行多次反应，则可通过数字PCR获得低浓度范围的准确定量。事实上，可将浓度校准品进行有限稀释，并按照泊松分布计算PCR反应的失败率和成功率。

4、精密度：

引起qPCR变异的因素很多，包括影响退火和变性的温度差异、取样误差导致的浓度变异和随机误差。qPCR的精密度主要受浓度影响，并随拷贝数增加而降低。最好进行多次重复测定，并将以SD误差线形式表示的批内变异(重复性)和校准曲线的CI (可信区间)在图中标示出来。变异系数CV不能用来描述Cq，但可用来表示拷贝数与浓度的变异。技术引起的变异应区别于生物学变异。生物学复制可直接导致组间或不同处理方法间qPCR结果的显著性差异。对于诊断分析，还需要报告不同地点和不同操作者的批间精密度(重现性)。

资料来源：2020版MIQE指南

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参考文献：

[1] Pfaffl M W . A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9):e45.

[2] Hellemans J , Mortier G , Paepe A D , et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data[J]. Genome Biology, 2007, 8(2).