四环素类药物（tetracyclines，TCs）是由放线菌属发酵产生或人工半合成的一类广谱抗生素，TCs在化学结构上属于氢化并四苯环衍生物。自1948年从金色链丝菌的培养液中分离出第一个TCs金霉素（CTC）用于治疗斑疹、泌尿道感染等疾病以来，TCs已发展了多个品种，常用的TCs有:四环素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、强力霉素（doxycycline，DC）、去甲基金霉素（demeclocycline，DMCTC）、甲烯土霉素（methacycline，MTC）和二甲胺四环素（minocycline，MINO）等。该类药物为广谱抗生素，具有良好的抑菌效果，因其价格便宜，且具有促生长作用，目前仍广泛应用于畜禽、水生生物等产业领域。但不合理使用以及不遵守休药期等，造成该类药物及其降解产物残留于动物组织及产品中，必然会危及人类健康。为了控制TCs在动物源性食品中的残留，欧盟、美国及我国等均规定了畜产品中TCs的MRL。

本部分综述了TCs的理化性质、药理学、危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 理化性质

TCs具有相似的化学结构（表5-21）和理化性质。TCs母核由A、B、C、D4个环组成，主要活性官能团包括C2位的酰胺基、C4位的二甲胺基、C10位的酚羟基等。TCs及其盐类均为黄色结晶粉末，无臭，味苦，在水中溶解度很小，在酸、碱、乙醇、极性有机溶剂（如丁醇、乙酸乙酯）中可溶。TCs含有二甲胺基呈弱碱性，含有酚羟基和烯醇型羟基而显弱酸性，因此TCs属于酸碱两性化合物，可与酸或碱结合生成盐。临床一般用其盐酸盐，具有良好的水溶性和稳定性。

在酸性和中性条件下，TCs在270nm和360nm处具有强的紫外吸收，在碱性溶液中或与金属离子螯合时还显示强的荧光性质。

TCs在干燥状态下较稳定，在弱酸性溶液中较稳定，在酸性溶液（pH2）、中性或碱性溶液pH7）中稳定性差，易发生差向异构化、降解及与金属离子发生络合反应。TCs的A环手性碳原子C4位二甲胺基易发生可逆的差向异构化作用，降解产物主要有差向四环素、脱水四环素、差向脱水四环素、差向金霉素、差向异金霉素、差向土霉素等。图5-28为强力霉素差向异构化的相互转换式：

2 药理学

TCs抗菌谱广，抗菌作用不强，为广谱抑菌剂。对TCs敏感的病原菌有链球菌、布鲁氏菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、炭疽杆菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和立克次氏体等，由于耐药菌株日益增多，因而TCs在临床应用中受到了一定影响。TCs目前多用于立克次氏体、衣原体、支原体等非细菌性感染和布鲁氏菌病等的诊疗。

TCs主要通过可逆性地结合核糖体30S亚单位和阻止甲酰蛋氨酰tRNA与核糖体mRNA复合体结合来抑制蛋白质的合成而发挥抑菌作用。TCs具有抗菌活性的最重要特征是每种药物的分子中都包括一个线性融合的四环素核。四环素分子通过一个或多个膜系统（革兰氏阳性菌和阴性菌各自具有不同的膜系统）才能与它们的靶位结合，从而达到有效的杀菌作用。

TCs口服易吸收，但不完全。口服吸收的速度和程度可因动物种属和胃肠内容物的含量而异。TCs易在牙齿和骨骼组织中沉淀。肾脏是TCs主要的排出器官。相当一部分TCs可由胆汁排入肠道，形成肝肠循环。

3 危害

TCs主要以原型经肾小球过滤排出，残留药物能沉积于骨及牙齿组织内，与新形成的骨、牙齿中所沉积的钙相结合，导致牙齿持久性地呈黄色，俗称“四环素牙”，使出生的幼儿乳牙釉质发育不全并出现黄色沉积，引起畸形或生长抑制。TCs易在肝脏中富集，造成肝损害。还可造成过敏反应、二重感染、致畸胎儿畸形。同时TCs常作为促进生长的饲料添加剂，以亚治疗剂量添加、饲喂食源性动物，造成TCs在动物源性食品中的残留，更为严重的是TCs容易诱导耐药菌株的产生，给人们身体健康带来安全隐患。

4 国内外限量要求

许多国家和国际组织对在食用动物养殖中使用的TCs和TCs在食品中的残留进行了严格的监控，对动物源性食品中TCs的MRL进行了相关规定，具体见表5-22。

5 样品处理方法

5.1 提取方法

在生物样品中，TCs易与蛋白质结合，通常酸性或弱酸性溶液为良好的提取溶剂，如EDTA缓冲液（0.1mol/LEDTA-McIlvaine，pH4.0）、丁二酸溶液。这些提取溶剂一方面能有良好的组织渗透性，并可使蛋白质变性起到脱蛋白质的作用，另一方面，在酸性条件下，两性的TCs能完全质子化，在水溶液中溶解度最大，易从生物样品中释放出来。盐酸、高氯酸、磷酸等酸性溶液也被用作TCs的提取溶液。还有报道用pH7.2咪唑缓冲液提取TCs。

有机溶剂如乙酸乙酯、乙腈、甲醇、三氯乙酸等也可作为TCs的有效提取溶剂。乙酸乙酯与酸性水溶液混合使用对动物组织中TCs有很好的提取效率。

由于生物样品中常含有二价阳离子，它们易对TCs的提取效率造成干扰，使回收率降低，因此提取溶剂中一般都含有EDTA，EDTA能有效消除金属离子与TCs的螯合作用。

5.2 净化方法

5.2.1 固相萃取（SPE）

SPE是TCs净化的主要方法之一。TCs具有苯环、多种活性官能团，因此各种类型的SPE都能用于TCs的净化，SPE主要包括C18、阳离子交换柱、苯基SPE柱、SAX柱等（表2-23）。

Aoyama等研究发现，未经处理的C18柱由于硅胶基表面硅烷醇基的存在及残余的金属离子，易与TCs紧密结合，而不能获得好的净化效果；经EDTA处理、端基封闭的硅胶键合相或加样溶液中含有EDTA则可获得较好的效果。苯基SPE柱、环己基SPE柱也能有效地净化TCs。

Zhu等比较了OasisHLB与Sep-PakC18两种SPE柱对OTC、TC、CTC的净化效果。OasisHLB和Sep-PakC18经6mL甲醇和6mL水活化后，20ng/mL的OTC、TC、CTC的提取液（pH2.5）上样，分别经10mL 5%甲醇水和10mL纯水洗涤，最后分别以2.5mL TFA∶甲醇（1∶99）和10mmol/L草酸甲醇溶液洗脱，经氮吹干、ESI-LC-MS/MS检测。

5.2.2 金属螯合亲和色谱（MCAC）

近年来，许多学者将MCAC作为净化TCs在动物源性食品中残留分析的一种新型技术，该技术能获得较高的回收率和低的检测限。MCAC的吸附填料经过硫酸铜水溶液处理，将含有TCs的提取液经MCAC净化，TCs能与铜离子相互作用达到与其他杂质分离的目的，再以EDTA-McIlvaine缓冲液洗脱。

Stubbings等使用在线MCAC-（HP）LC系统对动物组织中TCs残留进行了检测分析。MCAC柱先加入25μL 50g/L硫酸铜溶液、500μL水进行活化，提取的样品以0.36mL/min的流速上样，经500μL水、500μL甲醇、500μL水洗涤，最后以KH2PO4-柠檬酸-EDTA洗脱；MCAC柱再用KH2PO4-柠檬酸-EDTA/甲醇/乙腈和KH2PO4-柠檬酸-EDTA平衡再生。

5.2.3 基质固相分散技术（MPSD）

MSPD能够依靠填料颗粒的机械剪切力和键合相C18的去垢剂作用，集样品匀浆、提取、净化过程于一体，具有样品处理速度快、节约溶剂等优点，被广泛应用于兽药残留的分析。Long等首次将MSPD应用于牛奶中TCs残留的检测，将C18、EDTA-Na2、草酸和添加OTC、TC、CTC的牛奶样品研磨混合，制成半固态装柱、淋洗，最后以乙酸乙酯-乙腈（1∶3）洗脱药物，蒸干复溶，用HPLC-PDA测定；以100～3200ng/mL浓度添加样品，回收率为63.5%～93.3%。

Brandsteterova等比较了SPE和MSPD的净化效果，结果表明，TC、OTC、CTC以100ng/mL浓度添加于牛奶、肉、奶酪中时，经SPE和MSPD净化后的回收率分别为48%～86%和89%～93%，LOD分别为15～22n/mL和30n/mL。MSPD还被用于鲶、牛奶中TCs多残留的分析。5.2.4 自动序列透析/痕量富集（ASTED）

ASTED系统主要由采样、透析、富集三部分组成，其中以透析池和痕量富集柱（TEC）为核心。ASTED的净化过程一般为:待测物提取后以水溶液稀释，将样品自动注入透析池，通过编程控制样品与透析液的流量及保留时间，使样品溶液中的待测物透过半透膜传递到透析液中，蛋白质等大分子物质或细胞碎片被除去，透析液流过TEC，待测物被富集，然后再通过自动柱切换洗脱液进入LC色谱柱进行分离和检测。Zurhelle等使用ASTED净化，检测TCs在蛋白、蛋黄及鸡血清中的残留。10g蛋白加入20g0.3mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH5.75）作为提取液，10g蛋黄加入30g0.3mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH5.75），混合匀质，振荡5min，取5g上清液用10g柠檬酸钠缓冲液稀释；2g血清直接以4g柠檬酸钠缓冲液稀释，再进行ASTED净化，流动相为0.06mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0），TEC和LC色谱柱均为PLRP-S，检测波长为350/420nm。OTC、TC、CTC的LOD为11～15μg/kg，LOQ为34～45μg/kg。

此外，固相微萃取技术、微透析技术也被应用于TCs的检测，并可获得很好的净化效果。

6 残留分析方法

TCs在动物源性食品中残留的分析方法主要有薄层色谱法（TLC），毛细管电泳（CE），高效液相色谱法（HPLC），色质联用技术（LC-MS或LC-MS/MS）及免疫分析方法（RIA、ELISA）等。

6.1 薄层色谱法（TLC）

TLC又分为正相薄层色谱（NP-TLC）和反相薄层色谱（RP-TLC）。如表5-24所示，NP-TLC一般使用纤维素、硅胶、硅藻土等作为吸附层。总体而言，NP-TLC是一种简单的、不需特殊设备的分离方法，但在制板时却要花费大量时间消除TCs与金属离子的螯合作用，故通常在吸附剂和溶剂系统中加入EDTA以消除金属离子的影响。采用直接在TLC吸附板上喷射EDTA并进行活化来处理，但效果不佳。进一步改进后，将TLC吸附板在饱和EDTA水溶液中展开，使用前再进行活化，收到较好的效果。Oka等用该技术以高效TLC吸附板和氯仿-甲醇-5%Na2EDTA（65∶20∶5）的溶剂系统分离了8种TCs，并成功运用于蜂蜜中8种TCs的残留检测，检测限达到0.1mg/kg。

用RP-TLC分析TCs时，溶剂系统中通常加入草酸以消除金属离子的影响。RP-TLC溶剂体系中通常含有磷酸、柠檬酸、酒石酸、EDTA等以获得对TCs较好的分离效果，但脱尾现象比较严重；在RP-TLC溶剂系统中加入草酸后，可以消除TCs与金属离子的螯合作用，减少脱尾现象，但分离效果却不好。Oka等以同一溶剂系统对不同反相薄层板的分离效果进行了分析，研究发现，以甲醇-0.5mol/L草酸水溶液（1∶1）作为溶剂系统，C8薄层板能使TCs获得很好的分离效果，而C18薄层板可以很好地分离TCs的脱氢及差向异构化产物；以甲醇-乙腈-05mol/L草酸水溶液（1∶1∶4）作为溶剂系统，在C8薄层板上，可以使7种TCs（OTC、TC、CTC、DC、MINO、MTC、DMCTC）得到很好的分离效果，检测了在蜂蜜和动物组织中TCs的残留。

在用TLC分析TCs时，通常采用氯化镁、氯化铁、五氯化锑、硫酸、重氮化硝基苯胺、改进的坂口（sakaguchi）反应试剂、1，1-二苯基-2-苦基肼（diphenylpicrylhydrazyl）试剂及重氮盐等作为检测时的显色剂。Choma等通过对不同溶剂系统的选择和优化，可以同时检测TCs和喹诺酮类药物氟甲喹在牛奶中的残留，分离效果见图5-29。

为了进一步确证，FAB-MS已经引入了TLC对TCs在动物源性食品中残留的检测。

6.2 毛细管电泳（CE）

CE是近年来迅速发展起来的分离分析技术，其原理是根据不同组分在高压电场的作用下迁移速率的不同而达到对组分的分离。其特点是分析速度快、柱效极高，适合复杂样品中水溶性的带电或有不对称电荷中心的有机物或无机物质。

Chen等报道了同时测定牛奶、血清、尿中OTC、TC、CTC和DC的CE。样品经琥珀酸盐沉淀蛋白质，离心，取上层通过金属螯合亲和柱色谱净化，再以TrimethylsilanizedC18柱分离，TCs的回收率为40%～84%，RSD为3.3%～9.1%。

Hernndez等运用CE对猪肾脏、肝、肌肉组织中OTC的残留进行了分析，20mmol/L碳酸钠作为电解质溶液（1mmol/L的EDTA溶液调节pH至11.2），检测限低于MRL，肾脏、肝、肌肉组织经SPE净化处理，其LOD分别为160mg/kg、120mg/kg、85mg/kg，回收率平均为76%。Huang等以200mmol/L磷酸缓冲液（pH2.0）作为电解质溶液，对鲶中OTC的残留进行了检测，以0.1～5mg/kg添加时，平均回收率可达92.9%，RSD小于3.4%，如图5-30所示。

由于TCs能与很多金属离子发生螯合作用，为了提高CE的选择性和分离性能，近来非水溶性毛细管电泳（non-aqueous capillary electrophoresis，NACE）被用来进行动物源性食品中TCs残留的检测分析（图5-31），这一CE的电解质溶液为50mmol/L醋酸镁的N-甲基甲酰胺溶液，并选择镁离子作为增强TCs的荧光强度的螯合离子，结果表明，以有机溶剂替代水溶液的电解质溶液可增强TCs的荧光强度，提高CE的检测能力。Hernandez等用HLB固相萃取柱将猪血清净化后，以NACE分析猪血清中的OTC，以含25mmol/L乙酸钠、26mmol/L甲磺酸、1mmol/LEDTA的甲醇溶液-乙腈（50∶50，V/V，pH4.0）为电解质溶液，检测限为0.2～0.3mg/L，回收率为74%～100%。

6.3 高效液相色谱法（HPLC）

反向液相色谱（LC）操作简单、方法灵活，已成为包括TCs在内的许多药物残留检测的主要分析手段。在普遍使用的硅胶基反向键合相（C18、C8等）固定相表面存在残存的硅醇基或金属离子（如铁离子、铝离子），而TCs易与金属离子螯合，反向柱残存的硅醇基与TCs可以通过氢键或离子交换作用，导致色谱峰拖尾，保留值不稳定或过长，出现峰形异常和分离度下降。

近年来，很多学者将PLRP-S聚合色谱柱、Novapak苯基柱、Pursuit联苯基柱、Discovery氨基C16色谱柱、端基封闭处理的填料制备的色谱柱等运用到TCs残留的分析工作中。氨基C16色谱柱由于表面不存在硅烷骨架，所以能够避免TCs与硅醇基和金属离子的干扰作用。Rupp等发现联苯基柱较单纯苯基柱有更好的保留效能。PLRP-S聚合色谱柱为苯乙烯-二乙烯苯共聚物（PS-DVB），是一种有机高分子基质反向填料，不存在由硅胶基反向填料残存的硅醇基和金属离子导致的酸性或碱性药物色谱峰拖尾等问题，流动相组成简单，对pH和水具有更好的耐受性。PLRP-S聚合色谱柱或PS-DVB能够减少为获得满意的色谱峰形而优化流动相的大量工作，而日益被广泛应用。

为避免形成金属螯合物和在反向LC色谱柱上的吸附，在反向LC中，优化流动相的组成是TCs残留检测的重要方法之一。通常在流动相中加入有机酸（如磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、EDTA等）、有机改性剂（甲醇、乙腈等）、离子对试剂、掩蔽剂或扫尾剂等，以加草酸为多数。草酸能与金属离子螯合，有效地消除金属离子对TCs残留分析的干扰；另外，含有001mol/LEDTA的流动相可以有效避免TCs与残存的金属离子形成螯合物。

已报道的TCs残留的各种HPLC检测方法见表5-25这些分析方法的流动相pH通常为2～3.6，流动相的组成以低有机改性剂、高酸性水相溶液为共同的特点。

分析TCs残留时，流动相通常由乙腈和缓冲液组成，甲醇有时与乙腈共同作为有机改性剂使用。有机溶剂的成分、比例的选择比水相的组分、离子强度、柱温等因素对TCs的分离起更重要的作用。

为了改善TCs与硅胶基反向固定相的作用性质，防止拖尾，获得适宜的保留行为，在流动相中还加入辛磺酸、四丁基氯化铵、七氟丁酸、四丁基硫酸化铵、SDS等离子对试剂以获得更好的保留能力。在酸性流动相中，离子对试剂添加浓度一般为1～5mmol/L，浓度过高易发生簇集。

TCs具有较强的紫外吸收和荧光性质，且TCs的光谱性质很相似。由于TCs在中性或碱性介质（pH＝6.5～7.5）中，并有金属离子镁离子、钙离子、铜离子、铝离子等存在发生螯合时，才表现较强的荧光性质（λex＝380～390nm，λem＝490～520nm），故绝大多数TCs残留分析中使用的是的紫外检测法，仅有少数方法使用荧光检测法。

UV的检测波长为270nm和360nm，酸性的流动相（草酸缓冲液、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、草酸、磷酸、乙酸柠檬酸、高氯酸、三氟乙酸等）可作为离子抑制剂减少基质的干扰。在多残留分析中，近年来还采用二极管阵列检测器（DAD），以获得更好的波长分辨率和更高的灵敏度。Cinquina等以0.01mol/L草酸-甲醇-乙腈（60∶25∶15，V/V）为流动相（流速为1mL/min），PAD检测波长为365nm，对牛奶和牛肌肉组织中的OTC、TC、CTC、DC残留进行了检测，以100mg/kg添加，牛奶和牛肌肉的平均回收率分别为81%、82.3%，RSD小于5.8%（图5-32）。

由于TCs的化学结构中都含有10位取代酚羟基和4位二甲氨基，这些功能基团通过氧化作用后能够被电化学检测器所检测到。因此Zhao等利用HPLC-ED检测了绵羊奶中TCs残留，回收率达88%以上，RSD小于4.3%；样品前处理时间少于30min，检测分析时间少于15min，适合于TCs在绵羊奶中残留的筛选监测工作。

化学发光技术（chemiluminescence，CL）由于具有特异性高、选择性强、样品前处理简单、线性范围宽、不需特殊昂贵设备等优点，也被用来作为TCs残留的分析检测方法。其基本原理是:TCs与溴离子、N-溴琥珀酰亚胺、光泽精、六碳高铁酸盐、过氧化氢等发生氧化反应而进行快速检测。

Halvatzis等通过与N-溴琥珀酰亚胺进行化学发光反应，对TC、OTC、CTC等在蜂蜜中残留进行了检测分析。Wan等HPLC-CL检测了蜂蜜中TCs残留，用高锰酸钾-亚硫酸钠的磷酸溶液增强TCs的化学发光性质，在上述溶液中加入β-环糊精后，能够显著增强TCs的化学发光性质，信噪比显著提高，检测限可达到0.9～5.0ng/mL（图5-33），并还分别就磷酸、高锰酸钾、亚硫酸钠、β-环糊精的浓度与分析结果的影响进行了选择优化。

6.4 色/质联用分析

色/质联用分析的选择性和灵敏度都很高，在TCs残留的确证分析中应用很多。TCs的主要化学结构相同或相似，图5-34为TCs化学结构及裂解途径，因此色/质联用分析的分离条件、裂解方式比较一致，为TCs多残留确证方法的设计提供了方便。由于TCs具有高沸点、不易挥发等特点，TCs的色/质联用分析通常采用TLC-MS、LC-MS及LC-MS/MS，其电离或接口方式主要有热喷雾（TSI）、粒子束（PB）、快原子轰击（FAB）、大气压化学电离（APCI）、电喷雾电离（ESI）等。TCs主要的碎片离子有[M＋H]＋、[M＋H-NH3]＋、[M＋H-NH3-H2O]＋，如图5-35所示。

Oka等利用TLC-FAB-MS检测了OTC、TC、CTC、DC在牛组织和牛奶中的残留，LOD为50μg/kg。Crecelius等还利用TLC-基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测了TCs在动物源性食品中的残留。

Blanchflower等用APCI-LC-MS对动物组织中OTC、TC、CTC进行了多残留分析，为更好地确证分析，他们运用选择性离子监测（SIM）技术对质子化的分子离子进行分析，[M＋H]＋、[M＋H-NH3]＋、[M＋H-H2O]＋、[M＋H-NH3-H2O]＋、[M＋H-2H2O]＋为OTC、TC主要的特征分子离子，CTC的特征分子离子中无[M＋H-NH3-H2O]＋，LOD可达001～002mg/kg。

Carson等将用冰乙酸提取的牛奶和丁二酸（pH4）提取的虾样品上清液加入用硫酸铜处理的MCAC柱，依次用5mL 0.5mol/L氯化钠、10mL水、10mL甲醇和10mL水洗涤，用3mL含0.5mol/L氯化钠和0.1mol/LEDTA-Na2的McIlvaine缓冲液洗脱收集，再用SPE柱净化一次，甲醇洗脱，洗脱液体在45～55℃氮气下吹干，残渣用1mL水复溶，用PLRP-S分离柱，以甲醇-5mmol/L草酸（58∶42）做流动相，0.5mL/min的流速分离TCs，用LC-PB-MS进行检测。

Nakazawa等用APCI-LC-MS/MS建立了动物组织、蜂蜜、奶、鸡蛋、鱼组织中TCs的多残留分析方法，检测限为0.001mg/kg（TC、OTC）、0.004mg/kg（CTC）、0.002mg/kg（DC）。由于流动相中草酸和EDTA的存在，为避免毛细管接口堵塞及在离子源处沉积，因草酸可在高温下分解为二氧化碳和水，Nakazawa等通过调节APCI的表面温度和雾化器温度（将雾化器温度设为475℃），可使APCI至少保持1周不堵塞。

Cherlet等用0.1mol/L琥珀酸缓冲溶液（pH4.0）脱蛋白质，经HLB固相萃取柱净化，建立了猪肌肉、皮＋脂肪、肝、肾等组织中EOTC、OTC、ETC、TC、DMCTC、ECTC、CTC、EDOX和DOX9种TCs的LC-ESI-MS/MS多残留检测分析方法，监测到的特征分子离子主要有3组:①m/z444、428、462、428、448，分别为EOTC、ETC、ECTC、EDOX和DMCTC的[M＋H－NH3]＋；②m/z443、427、461，分别为EOTC、ETC、ECTC的[M＋H－H2O]＋，未监测到EDOX和DMCTC的[M＋H－H2O]＋；③m/z426、410、444、430，分别为EOTC、ETC、ECTC和DMCTC的[M＋H－NH3－H2O]＋，未监测EDOX的[M＋H－NH3－H2O]＋。同时研究者还注意到不同TCs和其差向异构体具有不同的[M＋H－NH3]＋/[M＋H－H2O]＋（相对丰度比），差向异构体的[M＋H-NH3]＋/[M＋H-H2O]＋通常高于TCs的，表明TCs差向异构体更容易丢失NH3。[M＋H-NH3]＋、[M＋H-H2O]＋可作为TCs和差向异构体定量的特征分子离子，而[M＋H-NH3-H2O]＋可作为TCs和差向异构体定性的特征分子离子，如图5-36所示。

Andersen等以0.1%蚁酸-乙腈-甲醇为流动相，流速为0.2mL/min，进样量20μL。虾、牛奶样品分别用10mL琥珀酸提取2次，虾组织额外用5mL含1g氧化铝的0.01mol/L草酸溶液提取，离心取上清液，经HLB固相萃取柱净化，洗脱液用氮气吹干后，用0.1%蚁酸复溶，进行LC-MS/MS分析、SRM监测。通过优化碰撞能量，使每个子离子得到最大的相对丰度，将母离子[M＋H]＋导入碰撞室，使母离子获得高效的碰撞诱导解离（CID），在SRM方式下，利用3个特征分子离子及其相对丰度对样品中的OTC、TC、CTC进行确证，母离子裂解的主要产物离子见表5-26。在虾组织中，以50～400ng/g添加的OTC、TC、CTC的平均回收率分别为82.9%、93.2%和76.8%，RSD分别为8.3%、7.2%和9.2%，在牛奶样品中，50～400ng/g添加的OTC、TC、CTC的平均回收率分别为86.0%、87.7%和79.8%，RSD分别为8.3%、4.0%和6.1%。

6.5 免疫分析方法

Meyer等利用改良的放射免疫法（RIA）对地表水和猪圈污水中TC的残留量进行了分析，首先将样品加到盛有TCs抗体的硼硅酸盐检测管中，再将3H标记的金霉素加入，混匀、涡旋、离心，再加入3mL闪烁（scintillation）流体，通过scintillation检测器监测3H的放射强度，最后通过计算获得TCs的量（图5-37），最低检测量可达1.0μg/L，并用LC-MS进行确证并比较，如表5-27所示，结果表明RIA是一种可靠、快速检测TCs残留的分析手段。

Alfredsson等利用Dipstick试剂条检测了蜂蜜和鸡蛋中OTC、CTC和TC的残留，蜂蜜和鸡蛋的检测限分别为25ng/kg和200ng/kg（图5-38），免疫分析可以快速筛选、监测待检样品，由于其存在假阳性，属于半定量分析技术，故Alfredsson等还运用LC-MS/MS进行了确证分析。