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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2021年5月27日

*编辑：俞纪元

01

背景介绍

纳米水凝胶对于人体组织的亲和性以及良好的机械性能等优点使其成为未来可穿戴设备的一种潜在解决方案。但是目前研究中的水凝胶无法完全适应生物环境的多样性。另外，大部分水凝胶的应用往往需要外部辅助设备，容易造成与人体组织接触不稳定，导致信号失真的问题。

为了解决这个问题，西南交通大学的鲁雄教授等受到天然贻贝类具有的生物粘性启发，使用银纳米颗粒（Ag NPs）和单宁酸螯合形成的极小纳米酶（TA-Ag）作为基底，开发出一种具有强粘附能力、良好的导电性以及催化抗菌活性的自成型水凝胶TA-Ag-PAA。首先，纳米酶自身具有很高的过氧化物酶（POD）活性，仿贻贝纳米酶可在无外界刺激下，催化水凝胶自成型。其次，利用其过氧化物酶活性可催化产生ROS，并结合Ag自身的抗菌活性，为水凝胶提供了优异的催化抗菌性能。后续的研究表明该材料具有促进伤口愈合的功能。另外，该水凝胶可以高效传导生物电流，使水凝胶可在无外部辅助固定下稳定检测人体生理信号。

02

图文导读

图 1单宁酸-银（TA-Ag）超小纳米酶的催化机理

(a）TA-Ag纳米酶通过超小银纳米颗粒（AgNPs）与单宁酸（TA）螯合生成，其中银纳米颗粒和单宁酸之间的电子转移保持苯酚-苯醌的动态氧化还原平衡。(b)纳米酶POD活性促进的水凝胶的自成型。(c)纳米酶赋予水凝胶动态催化抗菌活性。(d)苯酚-苯醌的动态氧化还原平衡，使极小TA-Ag纳米酶催化的水凝胶被用作粘合剂和导电生物电极来检测生物信号。

超小TA-Ag纳米酶是通过单宁酸还原银离子形成单宁酸螯合的银纳米酶（图1）。在银离子还原过程中，TA的部分酚羟基被氧化为醛基生成苯醌，苯醌和苯酚的结构形成了电子供体-受体复合物。苯酚-苯醌复合物存在动态氧化还原平衡，这使TA-Ag纳米酶能够表现出高氧化还原活性和稳定的类POD酶活性。TA-Ag纳米酶具有的POD酶活性使其可以在自由基引发剂（如过氧硫酸铵、APS等）的诱导下发生单体自催化聚合反应形成粘性导电水凝胶，这一反应在室温（25℃）下即可发生，不需要加热或紫外光照射。纳米酶的类POD催化活性和银的抗菌特性使水凝胶具有动态催化抗菌活性，纳米酶中酚羟基和醛羟基的粘附细菌的能力进一步增强了该材料抗菌活性。此外，超小TA-Ag纳米酶中苯醌-苯酚存在的动态氧化还原平衡保证了水凝胶拥有足够的多酚羟基，使得纳米酶催化水凝胶具有长期可恢复的粘附性。

图 2 超小TA-Ag纳米酶的表征以及催化动力学研究

(a)超小TA-Ag纳米酶的透射电子显微镜（TEM）图像；(b)超小TA-Ag纳米酶的X射线衍射（XRD）图像；(c)Ag NPs和TA-Ag纳米酶的高分辨率X射线光电子能谱（XPS）数据；(d)TA-Ag纳米酶和Ag NPs的POD酶活性；插入图像（EP管）表示3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的颜色变化。在(e)过氧化氢和(f)过氧硫酸铵（APS）存在下，不同TMB浓度的TA-Ag纳米酶米氏方程曲线；(g)在过氧化氢和过硫酸铵（APS）存在下使用:5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）捕获自由基的自旋电子共振（ESR）谱图；3-羟基-1,2-苯醌吸附在银（110）表面的密度泛函理论（DFT）研究，(h)等值为0.20 eÅ-3的电子密度差的三维图的侧视图；(i)俯视图。粘合长度以埃（Å）为单位，电荷积累和电荷消耗分别由红色和蓝色表示；(j)TA-Ag水凝胶自凝的原理图；(j1)水凝胶预聚合溶液注入模具中；(j2)注入的水凝胶通过纳米酶催化活性自成型；(j3)将水凝胶从模具上剥落；(j4)具有圆柱形微孔的自成型TA-Ag-PAA水凝胶的数码照片。

透射电镜图像（TEM）表面纳米酶具有平均直径为5纳米的极小球形结构。高分辨率TEM（HR-TEM）数据显示晶格间距值分别为2.3和2.0 Å，分别对应于Ag的（111）和（200）晶面（图2a）。X射线衍射（XRD）图像中的Ag衍射峰（图2b）以及X射线光电子能谱（XPS）中TA-Ag纳米酶的Ag 3d峰发生了位移，这进一步证实了纳米酶的成功合成（图2c）。TA-Ag纳米酶的POD酶活性比Ag NPs高出22倍，在过氧化氢存在的情况下将纳米酶加入到TMB溶液1分钟后颜色变为蓝色（图2d）。此外，纳米酶在APS存在的情况下也表现出很高的类POD酶活性。在过氧化氢和APS存在的情况下，TMB作为底物的纳米酶米氏常数（KM）分别为2.28 mM（图2e）和2.19 mM（图2f）。研究人员进一步使用 DMPO作为捕获剂捕获羟基自由基，电子自旋共振共振（ESR）图谱表明当存在TA-Ag和过氧化氢或APS时，ESR图谱显示了四个信号，证实了羟基自由基的存在（图2g）。密度泛函理论的模拟发现Ag-O之间存在相互作用，解释了电子转移问题（图2h，i）。TA-Ag纳米酶可以在没有外部刺激的情况下高效诱导PAA自凝形成水凝胶，凝胶时间可以通过改变纳米酶或APS的含量来控制（图2j）。

图 3 TA-Ag纳米酶的抗菌活性

(a)超小TA-Ag纳米酶通过在细菌表面的粘附并通过POD酶活性催化产生活性氧（ROS）以杀死细菌；(b-c)不同条件下处理菌液2小时后的照片和抑菌率；(d)共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像和(e)DCFH-DA/HPF染色的大肠杆菌荧光信号的半定量测定；(f-i)与超小TA-Ag纳米酶共孵育的大肠杆菌细胞的扫描电镜SEM图像和元素分布图；(j-k)纳米酶结合的水凝胶(0.18wt%)与表皮葡萄球菌和大肠杆菌的菌液共孵育一天后的照片和杀菌比率。

在过氧化氢存在的情况下，TA-Ag纳米酶的POD酶活性可以快速催化产生羟基自由基，使细菌失活。TA-Ag纳米酶对细菌的粘附性缩短了ROS与细菌的作用距离，增强了ROS的杀菌作用（图3a）。在过氧化氢存在下，TA-Ag纳米酶的细菌悬浮液清澈，对两种细菌的杀菌率均达到90%左右（图3b，c）。细胞内ROS水平的测定结果说明TA-Ag纳米酶在与细菌作用过程中可以催化过氧化氢分解产生大量自由基，表现出高效的POD酶活性（图3d，e）。细菌与TA-Ag纳米酶作用后扫描电镜观察到很多纳米酶附着在细菌表面上，直观说明了TA-Ag纳米酶与细菌之间的粘附作用（图f-i）。24小时长效抗菌结果说明了TA-Ag-PAA水凝胶良好的广谱抗菌活性，其杀菌率能达到98%以上（图j，k）。

图 4 TA-Ag-PAA的粘性性能

(a)水凝胶粘附在各种表面上（TA-Ag纳米酶的含量为0.22wt%）；(b)水凝胶与不同底物的粘合强度；(c)水凝胶对猪皮肤组织的可恢复粘合强度；(d)水凝胶在重复粘附30次后长期粘附到人的皮肤组织上而不引起刺激；(e)仿贻贝类水凝胶的粘附机理：(i)贻贝类粘附机理，(ii)极小TA-Ag纳米酶在水凝胶内创造氧化还原环境，保持酚醛羟基平衡以进行持久粘附，(iii)水凝胶与各种底物之间的相互作用：I. 氢键，II. 配位键，III. 阳离子-π键相互作用，IV. π–π 相互作用，V.共价键。

接下来，研究人员评估了TA-Ag-PAA水凝胶自粘性（图4）。水凝胶可以粘附在各种表面上，包括圣女果、玻璃瓶、鼠的肝脏和金属螺母（图4a）。定量拉伸粘附试验结果表明水凝胶对玻璃、钛、聚四氟乙烯（PTFE）和猪皮的粘附强度分别为35、45、54和26kPa（图4b）。此外，在30个周期的剥离粘附试验后水凝胶仍然强烈地粘附在猪的皮肤上，表明其具备可恢复的和长期的粘附性（图4c）。它也可以在人类皮肤上反复粘附和剥离，而不会造成任何伤害或刺激（图4d）。可重复和长期的粘附性是由于水凝胶网络内极小TA-Ag纳米酶形成的动态苯酚-苯醌氧化还原系统，提供了足够的酚醛羟基粘附，这与贻贝类粘附的机理相似（图4e-i-ii）。修饰在TA-Ag纳米酶表面的苯酚-苯醌复合物可以与不同的底物产生不同的化学作用力，如图4e-iii所示。

图 5 TA-Ag-PAA水凝胶的导电性以及

其在生物电子领域的应用

(a)显示水凝胶具有良好导电性的照片；(b)TA-Ag含量与水凝胶的电导率关系；(c)水凝胶上的C2C12细胞的高通量电刺激；(d)经培养三天后的C2C12成肌细胞的激光扫描共聚焦图像；(e)细胞增殖；(f)纵横比；(g)水凝胶在兔子头部植入电极测量肌电图（EMG）信号；(i)电极位置和外部刺激的原理图；(ii)手术；(iii)兔子受弱电流刺激时发出EMG信号；(iv)按压兔子耳朵时发出EMG信号；(h)水凝胶作为人体皮肤上的表皮电极，以检测(i)心电图（ECG）和(ii)EMG信号。

因为超小的TA-Ag纳米酶在PAA网络中充当了导电的纳米填充剂，TA-Ag-PAA水凝胶表现出优异的导电性。将水凝胶连接到发光二极管（LED）电路中可以传导电流（图5a）。电导率随着TA-Ag纳米酶的含量的增加而增加，最大值为21 S m-1 （图5b）。TA-Ag-PAA水凝胶具有良好的细胞亲和力，通过超小TA-Ag纳米酶的酚醛羟基能促进细胞粘附和增殖。细胞亲和性和电导率可通过酚醛羟基和电刺激下的电信号（ES）影响细胞在水凝胶上的生长，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到，在300到600mV的电流下TA-Ag-PAA水凝胶上的C2C12细胞比PAA水凝胶上有更好的粘附和生长（图5c，d）。使用MTT法进一步评估了水凝胶上的细胞增殖（图5e）。TA-Ag-PAA水凝胶上的细胞增殖高于PAA水凝胶，表明水凝胶中的TA-Ag纳米酶无细胞毒性，这些细胞在600 mV的电流下生长情况最好。此外，导电水凝胶上的细胞具有很高的纵横比，表明导电水凝胶对肌管形成的早期阶段有促进作用（图5f）。生物相容性、粘附性和电导性等优点的结合使水凝胶可以用作可植入的生物电极。将导线连接的水凝胶电极植入兔背肌，施加微弱电刺激和耳朵压力后清晰检测到EMG信号（图5g-i-ii -iii-iv）。水凝胶电极也被连接在人的皮肤上，以检测心电和肌电信号（图5h-i-ii）。

图 6 TA-Ag-PAA 水凝胶的力学性能

(a)TA-Ag-PAA水凝胶被延长到其初始长度的20倍并恢复；(b)TA-Ag-PAA水凝胶的循环拉伸装卸曲线；(c)典型的拉伸应力-应变曲线；(d)各种水凝胶的强度和延展性产物以及(e)断裂能；(f)TA-Ag-PAA水凝胶的压缩回收性能；(g)TA-Ag-PAA水凝胶的循环压缩装卸曲线；(h)SEM图像和(i)干燥的TA-Ag-PAA水凝胶中的银元素分布图；(j)超小TA-Ag纳米酶填充的TA-Ag-PAA水凝胶的示意图。

TA-Ag-PAA水凝胶表现出优异的可伸缩性、弹性和韧性，水凝胶可以被拉伸到其初始长度的20倍而不断裂，并能够恢复到其原来的长度（图6a）。TA-Ag-PAA水凝胶在拉伸循环中显示出较小的滞后现象，表明具有良好的拉伸可恢复性（图6b）。水凝胶的应力-应变曲线表明TA-Ag纳米酶是水凝胶力学性能的重要决定因素。对比发现TA-Ag纳米酶质量占比为0.22 wt%的水凝胶具有最好的强度和延展性，其断裂能量高达1845 J m-1（图6c-e），且移除外力后水凝胶可以恢复到原来的形状（图6f）。TA-Ag-PAA水凝胶在六次拉伸循环后的装卸应力-应变曲线进一步表明该材料作为纳米填充剂对于水凝胶机械性能的增强作用（图6g）。除此之外，TA与PAA之间可以产生很强的非共价作用力，（图6j），这两个因素的协同作用赋予TA-Ag纳米酶掺杂的纳米水凝胶卓越的机械性能。

图 7 纳米酶掺杂水凝胶

(a)动物手术的示意图伤口经过不同处理的(b)数码图像和(c)伤口闭合率；(d)21天后H&E组织学切片的图像，蓝色箭头表示水肿组织，绿色箭头表示肉芽组织；(e)水凝胶的体内抗菌评估，(e-i)无水凝胶的空白组，(e-ii)结缔组织的H&E染色切片，(e-iii)植入PAA水凝胶条件下接种大肠杆菌感染伤口，(e-iv)水凝胶周围的结缔组织的H&E染色切片，(e-v)TA-Ag-PAA水凝胶良好的体内抗菌活性，(e-vi)H&E染色切片，蓝色箭头表示多细胞组成的巨细胞。

具有丰富酚醛基的纳米酶水凝胶与周围组织可以紧密结合作为伤口修补剂，研究人员利用全厚度皮肤缺陷的体内模型来评估在TA-Ag-PAA水凝胶治疗后的组织再生情况（图7a）。如图7b所示，TA-Ag-PAA水凝胶比PAA水凝胶或没有水凝胶的空白组愈合更有效，植入21天后在TA-Ag-PAA水凝胶组的伤口基本完全愈合，结果显示TA-Ag-PAA水凝胶的伤口愈合率明显高于空白组（图7c）。21天后的苏木精-伊红染色的结果也说明了与空白组相比使用TA-Ag-PAA水凝胶处理的伤口的新生组织质量最好（图7d）。研究人员在大鼠模型上进行了体内抗菌试验，在大鼠皮下植入不同材料以及大肠杆菌菌液，植入7天后对植入部位的发炎感染情况以及H&E染色组织切片进行观察，对比验证了TA-Ag-PAA水凝胶在体内的高抗菌活性（图7e- i- vi）。

03

总结与展望

本研究中所合成的自成型TA-Ag纳米酶掺杂水凝胶TA-Ag-PAA是一种具有很高的POD酶活性，可高效传导生物电流，具有良好的机械性能，抗细菌感染以及促进伤口愈合功能的多功能新型纳米水凝胶材料。这种新型水凝胶具有的多种功能使其在粘性生物传感器、可穿戴设备和伤口治疗等方向具有广泛的应用前景，为未来植入型智能可穿戴设备提供了一种可行的解决思路。

原文：Jia, Z.R., et al., Mussel-inspired nanozyme catalyzed conductive and self-setting hydrogel for adhesive and antibacterial bioelectronics. Bioactive Materials 6 (2021) 2676–2687

撰稿 | 曹浩林

编辑 | 周逸夫

审阅 | 陈雷，王小宇